Entdecken Sie die bahnbrechende Arbeit bei der Entwicklung und Validierung von Wachstumshemmungstests für von Patienten stammende Melanomzelllinien, sowohl mit als auch ohne BRAF-Mutationen. Bei diesem Pilot-Arzneimittelkombinations-Hochdurchsatz-Screening wurden 45 paarweise Kombinationen mit 10 Arzneimitteln ausgewertet. Spannenderweise zeigten die Ergebnisse, dass die Kombination von Dasatinib mit BRAF-Inhibitoren oder MEK-Inhibitoren die Empfindlichkeit gegenüber Wachstumshemmung erhöht und die Zytotoxizität steigert, unabhängig vom BRAF-Status. Diese datenbasierten Erkenntnisse eröffnen neue Möglichkeiten für wirksame Melanom-Kombinationstherapien.
Wir beschreiben die Entwicklung, Optimierung und Validierung von 384-Well-Wachstumshemmungstests für sechs von Patienten stammende Melanomzelllinien (PDMCLs), drei Wildtyp (WT) für BRAF und drei mit V600E-BRAF-Mutationen. Wir führten ein Pilot-Wirkstoffkombinations-(DC)-Hochdurchsatz-Screening
(HTS) von 45 paarweisen 4×4-DC-Matrizen durch, die aus 10 Arzneimitteln in den PDMCL-Assays hergestellt wurden: zwei B-Raf-Inhibitoren (BRAFi), ein MEK-Inhibitor (MEKi) und ein für Melanome zugelassenes Methylierungsmittel; zytotoxische Topoisomerase-II- und DNA-Methyltransferase-Chemotherapien; und Medikamente, die auf das Basenexzisions-DNA-Reparaturenzym APE1 (Apurin-/Apyrimidin-Endonuklease-1/Redox-Effektor-Faktor-1), Tyrosinkinasen der SRC-Familie, das molekulare Chaperon Hitzeschockprotein 90 (HSP90) und Histondeacetylasen abzielen.
In diesem Artikel diskutieren wir die Entwicklung und Validierung von 384-Well-Wachstumshemmungstests für von Patienten stammende Melanomzelllinien mit und ohne BRAF-Mutationen. Die Tests wurden verwendet, um ein Pilot-Hochdurchsatz-Screening von Arzneimittelkombinationen mit 45 paarweisen Arzneimittelkombinationen unter Verwendung von 10 Arzneimitteln durchzuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass Dasatinib in Kombination mit BRAF-Inhibitoren oder MEK-Inhibitoren unabhängig vom BRAF-Status synergetisch die Empfindlichkeit gegenüber Wachstumshemmung erhöht und die Zytotoxizität verstärkt. Diese Ergebnisse liefern eine datengestützte Begründung für die weitere Untersuchung dieser Arzneimittelkombinationen als potenzielle Melanom-Kombinationstherapien.
PDMCLs (Patient-Derived Melanoma Cell Lines) wurden zwischen 2007 und 2013 von vier weiblichen und zwei männlichen Melanompatienten mit Tumoren aus verschiedenen anatomischen Regionen etabliert. Die Zelllinien wurden nach manueller und enzymatischer Verdauung resezierter Melanomtumorproben von Patienten initiiert, die verschiedenen Behandlungsschemata unterzogen wurden: Einzel- oder Kombinationstherapie mit hochdosiertem Interferon-α, Interleukin-2, Melphalan-Perfusion, Ipilimumab oder Vemurafenib .
Für das Pilot-DC-HTS wurden aus den 10 Testverbindungen insgesamt 45 paarweise 4×4-DCMs erzeugt und diese auf 3×384-Well-Masterplatten angeordnet. Zusätzlich zu den neun DC-Vertiefungen enthielt jedes 4×4 DCM eine DMSO-Kontrolle und drei Vertiefungen zur Einzelmedikamentenkontrolle für jedes der beiden Arzneimittel in den getesteten Konzentrationen innerhalb der Matrix. Die 10-fach-Masterplatten von Quelle A (40 μl) und Quelle B (20 μl) wurden manuell mit einer Matrixpipette angeordnet (Suppl. Abb. 1). Der 384-Well-Transferkopf der Janus MDT Mini-Plattform wurde verwendet, um 20 μl von Platte A in Platte B zu übertragen und die DC-Masterplatten zu mischen. 20 μl DMSO wurden in die einzelnen Arzneimittelvertiefungen und 40 μl in die DMSO-Kontrollvertiefungen gegeben. Der 384-Well-Transferkopf des Janus MDT Mini wurde verwendet, um 2 μl von den DC-Masterplatten in barcodierte Replika-Tochterplatten zu übertragen, die dann 5 Minuten lang bei 50 × g zentrifugiert, mit Aluminiumfolie versiegelt und bei –20 °C gelagert wurden °C bis zur Verwendung.
Die Exposition gegenüber festen DC-Verhältnissen von Dasatinib plus einem der BRAFis oder MEKis interagierte synergistisch, um die Empfindlichkeit gegenüber Wachstumshemmung zu erhöhen und die Zytotoxizität unabhängig vom PDMCL-BRAF-Status zu erhöhen (Abb. 3). Feste DC-Verhältnisse von Dasatinib plus BRAFis oder MEKis hemmten synergistisch das Wachstum von Maus-Melanomzelllinien, die entweder empfindlich gegenüber Dabrafenib waren oder eine Resistenz gegen Dabrafenib mit Kreuzresistenz gegen Vemurafenib, Trametinib und Datastinib entwickelt hatten. Einarmige Dasatinib-Studien zeigten eine statistisch signifikante QTc-Verlängerung von 3–6 ms in den Elektroenzephalogrammen (EKGs) von Patienten, die Dasatinib erhielten. Die klinische Bedeutung der QTc-Verlängerung ist jedoch ungeklärt, da nur 1 % der Patienten einen klinisch signifikanten Schwellenwert von 500 ms überschritten und nur 2,9 % eine Erhöhung über einen signifikanten Schwellenwert von 60 ms gegenüber dem Ausgangswert erlebten.60 Obwohl 4 % der mit Dasatinib behandelten Patienten an Herzinsuffizienz oder ventrikulärer Dysfunktion litten, hatten >50 % der Patienten eine Vorgeschichte von Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
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